En este trabajo se presenta una estrategia combinada que buscaba, primero, analizar por métodos computacionales la secuencia de la enzima ubiquitina carboxilo-terminal hidrolasa 14 de Giardia intestinalis (UBP6) reportada para buscar componentes relacionados con su función hipotética y segundo, determinar si el gen que codifica para la proteína se expresa en G. intestinalis y si lo hace, cómo es su patrón de transcripción a lo largo del ciclo de vida del parásito. Se encontró que la proteína pertenece a la familia de deubiquitinasas dependientes de cisteína y más específicamente a las proteasas específicas para ubiquitina (USPs por ubiquitin specific proteases). También se identificaron el centro catalítico con la triada completa así como características típicas del motivo USP. Teniendo en cuenta que los resultados computacionales sugieren que la enzima puede ser funcional, se usó la técnica de transcripción reversa acoplada a PCR como un primer acercamiento para establecer si el gen codificante se expresa en el parásito. De manera interesante, se determinó no solo que el gen se expresa sino que existe una variación de su transcripción a lo largo del ciclo de vida del parásito. Estos hallazgos son el punto de partida para posteriores estudios ya que sugieren de manera preliminar que esta enzima podría estar involucrada en el recambio de proteínas que ocurre en el parásito durante el proceso de enquistación. Aunque preliminar, este estudio es el primer reporte acerca de una enzima deubiquitinadora específica en el parásito G. intestinalis.

This paper presents a combined approach with two aims. The first is to analyze the reported sequence of the enzyme ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 14 of Giardia intestinalis (UBP6) through computational methods to find components related with its hypothetical function. The second is to determine if the protein-coding gene is expressed in G. intestinalis and, if such is the case, also determine its transcription pattern along the life cycle of the parasite. It was established that the protein belongs to the family of Cys-dependent deubiquitinases and more specifically to ubiquitin specific proteases (USPs). Moreover, the catalytic center with the complete triad as well as typical features of the USP motif were also identified. Since the computational findings suggest that the enzyme could be functional, reverse transcription coupled to PCR was used as a first approach to establish if in fact the coding gene is expressed in the parasite. Interestingly, it was found not only that the gene is expressed, but also that there is a transcription variation along the life cycle of the parasite. These two findings are the starting point for further studies since they tentatively suggest that this enzyme could be involved in the protein turnover that occurs during parasite encystation. Although preliminary, this study is the first report concerning the study of a specific deubiquitinating enzyme in the parasite G. intestinalis.

Este artigo apresenta uma abordagem combinada com dois objetivos. A primeira é analisar a sequência informou da enzima ubiquitina carboxil-terminal hidrolase 14 de Giardia intestinalis (UBP6) através de métodos computacionais para encontrar os componentes relacionados com a sua função hipotética. A segunda é para determinar se o gene de codificação da proteína é expressa em G. intestinalis e, se for o caso, também determinar o seu padrão de transcrição ao longo do ciclo de vida do parasita. Foi estabelecido que a proteína pertence à família de deubiquitinases Cys-dependentes e mais especificamente para proteases específicas de ubiquitina (USPs por ubiquitin specific proteases). Além disso, o centro catalítico com a tríade completo, bem como as características típicas do motivo USP também foram identificados. Uma vez que os resultados computacionais sugerem que a enzima poderia ser funcional, a transcrição reversa acoplada a PCR foi utilizado como uma primeira abordagem para determinar se, de facto, o gene codificante é expressa no parasita. Curiosamente, verificou-se não só que o gene é expresso, mas também que há uma variação de transcrição ao longo do ciclo de vida do parasita. Estes dois elementos são o ponto de partida para estudos posteriores, uma vez que tentativas sugerem que esta enzima pode estar envolvida no refill de proteínas que ocorre durante o parasita encistamento. Embora preliminares, este estudo é o primeiro relatório relativo ao estudo de uma enzima deubiquitinadora específica no parasita intestinalis.

The reproductive mechanism of Giardia intestinalis, considered one of the earliest divergent eukaryotes, has not been fully defined yet. Some evidence supports the hypothesis that Giardia is an exclusively asexual organism with a clonal population structure. However, the high genetic variability, the variation in ploidy during its life cycle, the low heterozygosity and the existence of genes involved in the meiotic-like recombination pathway in the parasite's genome cast doubt on exclusively asexual nature of Giardia. In this work, semiquantitative RT-PCR analysis was used to assess the transcription pattern of three meiosis-like-specific genes involved in homologues recombination: dmc1, hop1 and spo11. The mRNAs were amplified during the parasite's differentiation processes, encystation and excystation, and expression was found at each stage of its life cycle. A semiquantitative assessment also suggests that expression of some of the genes is regulated during encystation process.